اندازه گیری مقدار کلروفیل در بسیاری از تحقیقات مربوط به سلامت و تغذیه گیاه با توجه به اهمیت بالای آن در فیزیولوژی گیاه، امری مرسوم و متداول است. کلروفیل در جذب و تبدیل انرژی نورانی و همین طور انتقال الکترون، که از جمله فرایند های حیاتی در فتوسنتز به حساب می آیند، نقشی کلیدی ایفا می کند.
مقدار رنگیزه های فتوسنتزی تا حد زیادی تحت تاثیر استرس های زنده (به طور مثال پاتوژن ها) و غیر زنده (مانند تنش های دمایی) قرار می گیرد. بنابراین کمی سازی مقدار کلروفیل می تواند بیانگر اثر عوامل محیطی بر رشد گیاه باشد.
رنگیزه های فتوسنتزی که به شکلی مرسوم مورد بحث قرار می گیرند شامل کلروفیل a، کلروفیل b و کارتنوئید می باشد. بیشترین جذب نور توسط کلروفیل a و b به ترتیب در طول موج های 680 nm (نور قرمز) و 470 nm ( نور آبی- بنفش) اتفاق می افتد. کارتنوئید ها نیز در طول موج 550 nm بیشترین فعالیت را دارا هستند. کلروفیل ها به رنگ سبز و کارتنوئید ها عمدتا به رنگ زرد یا قرمز دیده می شوند.
تفاوت کلروفیل a و b در گروه ه ای عاملی آن ها است. کلروفیل a دارای–CH3 و کلروفیل b دارای گروه عاملی –CHO می باشد. ساختار هر سه رنگیزه فتوسنتزی در زیر به نمایش گذاشته شده است.
برای بزرگنمایی، بر روی تصویر کلیک کنید!
برای بزرگنمایی، بر روی تصویر کلیک کنید!
تاثیر میزان کلروفیل بر ظرفیت فتوسنتزی و در نهایت رشد گیاه از مدت ها پیش شناخته شده است. به طور کل هرچه گیاه از نظر رنگیزه های فتوسنتزی در وضعیت مطلوب تری قرار داشته باشد، از سلامت بیشتری نیز برخوردار خواهد بود. این امر در سامانه های کشاورزی بسیار حایز اهمیت است. چرا که نه تنها محتوای کلروفیل بر عملکرد نهایی محصول تاثیر گذار است، بلکه در ماندگاری آن پس از برداشت و همین طور بازار پسندی محصولات کشاورزی نیز موثر است.
امروزه با افزایش محبوبیت رژیم های گیاهی، مصرف گیاهان برگی سبز اهمیت روز افزونی پیدا کرده است. در این راستا، علم پزشکی گویای اثرات مفید کلروفیل بر سلامت انسان می باشد. استفاده متداوم از گیاهانی که دارای مقادیر بالایی از کلروفیل هستند (مانند اسفناج و جعفری)، باعث بهبود مشکلات ناشی از قند خون، سم زدایی، بهبود سیستم گوارش و کاهش حساسیت نسب به Allergen ها می شود. بر اساس مطالعه ای که به مقایسه محتوای کلروفیل در ده گیاه تجاری مرسوم پرداخته است، گیاه کلم حاوی کمترین میزان و کلم بوک چوی دارای بیشترین مقدار کلروفیل بوده است.
برای بزرگنمایی بر روی تصویر کلیک کنید!
[Abbreviation: Chinese kale (Kai), Chinese flowering cabbage (Cha), spinach (Bay), water spinach (Kan), cassava leaf (Sin), green leaf lettuce (Sel), Chinese cabbage pak-choi (Pch), basil (Kgi), sword-leaf lettuce (Sak), head cabbage (Kbs).]
میزان کلروفیل نه تنها بین گونه ها و واریته های مختلف متفاوت است، بلکه مقدار آن در بیوم های مختلف نیز فرق می کند. به طور کل گیاهانی که در محیط های جنگلی رشد پیدا کرده اند سبز تر از گیاهان موجود در علف زار ها می باشد. گیاهان در زیست بوم های جنگلی با سنتز بیشتر کروفیل، با میزان محدود نور در اشکوب خود سازگار می شوند. در مقابل محتوای کلروفیل گیاهان در علف زار ها کمتر از گیاهان جنگلی است. به علت فراهم بودن نور زیاد، این گیاهان مقدار کمتری کلروفیل سنتز کرده و روشن تر دیده می شوند. روند کلی تغییرات میزان کلروفیل در گیاهان مختلف به ترتیب زیر است:
Trees < shrubs < herbs, coniferous trees < broadleaved trees, and evergreens < deciduous trees
یکی از معتبر ترین روش های ارائه شده برای اندازه گیری مقدار کلروفیل در گیاه، روش ارایه شده توسط Arnon (1949) می باشد. این روش، بر حلالیت کلروفیل در محلول Acetone استوار می باشد. با آغشته شدن بافت های گیاهی به استون، رنگیزه ها در آن حل شده و سپس Optical Density محلول حاصل توسط دستگاه Spectrophotometer در طول موج های 470 nm، 645 nm و 663 nm قرائت می شود. کارتنوئید، کلروفیل b و کلروفیل a به ترتیب بیشترین فعالیت را در طول موج های ذکر شده از خود نشان می دهند.
مواد و ابزارمورد نیاز:
| مواد و ابزار | مورد نیاز |
| نمونه برگ | لوله فالکون |
| دستمال کاغذی لوله فالکون | Centrifuge |
| ترازو | قیف |
| هاون (Pestle and mortar) | کاغذ صافی |
| مزور | بالون ژوژه |
| Acetone 80% | Spectrophotometer |
مراحل کار:
ü سطح برگ مورد نظر را با استفاده از یک دستمال کاغذی خشک با دقت تمیز می کنیم.
ü 0.5 g از نمونه برگ را توزین کرده و در هاون قرار می دهیم.
ü 5 ml از محلول Acetone 80% به هاون اضافه کرده و نمونه گیاهی را به خوبی له می کنیم. (در صورت لزوم می توان مقدار بیشتری استون به هاون اضافه کرد تا برگ کاملا له شود.)
ü در مرحله بعد مخلوط برگ له شده و استون را به یک لوله فالکون منتقل می کنیم. (می توان با اضافه کردن استون و شستشو هاون با آن، از انتقال پیدا کردن تمام نمونه به داخل لوله فالکون اطمینان حاصل کرد. در مجموع 20 ml استون به نمونه اضافه خواهد شد.)
ü لوله حاوی نمونه برگ را به مدت 5 دقیقه در Centrifuge قرار می دهیم. (5000-10000 rpm)
ü سپس محلول را با استفاده از قیف و کاغذ صافی به یک بالون ژوژه 100 ml منتقل کرده و به حجم می رسانیم.
ü با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر، قابلیت جذب نور محلول را در سه طول موج مختلف ارزیابی کرده و در آخر با استفاده از فرمول های زیر، مقدار رنگیزه های فتوسنتزی را محاسبه می کنیم.
برای بزرگنمایی، بر روی تصویر کلیک کنید!
نکته: ورود هر گونه Stray Light ( نوری خارجی با طول موج متفاوت ) به درون نمونه، نوسانات در ولتاژ، ارتعاشات، Contaminations و افزایش دمای نمونه می تواند باعث بروز خطا در قرائت های اسپکتروفتومتری شود.
منابع:
ب. متشرع زاده. 1395. تقریرات درس مدیریت تغذیه گیاه. گروه علوم و مهندسی خاک، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران.
Chlorophyll. Retrieved from https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/chlorophyll.
Rajalakshmi, K. Extraction and Estimation of Chlorophyll from Medicinal Plants . Retrieved from https://www.ijsr.net/archive/v4i11/NOV151021.pdf.
Hu, X., Tanaka, A. & Tanaka, R. Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples. Plant Methods 9, 19 (2013) doi:10.1186/1746-4811-9-19
Maloney, L. (2018, December 6). What Kind of Food Contains a High Amount of Chlorophyll? Retrieved from https://healthyeating.sfgate.com/kind-food-contains-high-amount-chlorophyll-11022.html.
Li, Ying, Hou, Jihua, Xu, Li, … Xiuqin. (2018, April 30). Factors Influencing Leaf Chlorophyll Content in Natural Forests at the Biome Scale.
L.Limantra. Analysis on the Chlorophyll Content of Commercial Green Leafy Vegetables. Procedia Chemistry.Volume 14, 2015, Pages 225-231.